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      載體是攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具，是分子克隆技術(shù)不可或缺的重要組成部分，其中，質(zhì)粒是最常用的載體。面對(duì)日益繁多的質(zhì)粒，正確閱讀質(zhì)粒圖譜是進(jìn)行分子克隆的前提。本文將介紹如何閱讀質(zhì)粒圖譜。

 

一、質(zhì)粒的概念及分類

1.概念

      質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中，絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的，少部分為RNA型。天然DNA質(zhì)粒大都具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，其分子量范圍為1-300 kb。

天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足基因工程載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建，所以目前使用的質(zhì)粒多為人工改造的質(zhì)粒。

理想的質(zhì)粒應(yīng)滿足以下條件：

①?gòu)?fù)制能力：具有獨(dú)立的復(fù)制能力，在細(xì)胞中能大量繁殖，從而使目的基因大量擴(kuò)增；

②表達(dá)能力：作為表達(dá)載體應(yīng)能利用宿主的酶系統(tǒng)，表達(dá)目的基因； 

③穩(wěn)定性高：細(xì)胞內(nèi)能持續(xù)復(fù)制和表達(dá)；

④酶切位點(diǎn)：具有適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶識(shí)別和切割位點(diǎn)，即外源基因插入部位；

⑤遺傳標(biāo)記：便于重組體的篩選和鑒定；

⑥分子量小：以容納較大的外源基因。

2.分類

（1）按功能分類:克隆載體、表達(dá)載體

       克隆載體（cloning vector）：具有克隆載體的基本元件（復(fù)制起始位點(diǎn),抗性基因,多克隆位點(diǎn)等)，可以攜帶DNA片段或外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞并克隆和擴(kuò)增DNA片段或基因的載體。

表達(dá)載體（expression vector）：除了具有克隆載體的基本元件外，還有可以表達(dá)調(diào)控目的基因的元件，即轉(zhuǎn)錄翻譯所必需的DNA序列。

（2）按受體細(xì)胞的類型分類：原核載體、真核載體和穿梭載體

       原核載體（prokaryotic vector）：能在原核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的載體真核載體（eukaryotic vector）：能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的載體

穿梭載體（shuttle vector）也叫轉(zhuǎn)移載體（transfer vector），指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運(yùn)載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）。穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個(gè)復(fù)制子，以確保能夠在原核和真核兩種宿主細(xì)胞中復(fù)制與擴(kuò)增，并可以在真核細(xì)胞中有效表達(dá)。

 

二、質(zhì)粒的基本元件

1.復(fù)制起點(diǎn)（Origin of replication，ori）

       DNA復(fù)制起始位點(diǎn)ori負(fù)責(zé)控制質(zhì)粒復(fù)制的起始，原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)；而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。若質(zhì)粒圖譜上只有一個(gè)ori，表示質(zhì)粒是原核克隆及表達(dá)質(zhì)粒；而圖譜上有兩個(gè)ori，則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，既可以在原核也可以在真核中復(fù)制。

2.啟動(dòng)子（promoter, P）

       與RNA聚合酶特異性結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。含有RNA 聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列。

真核細(xì)胞含有三類RNA聚合酶，因此真核啟動(dòng)子還分為I、II、III類啟動(dòng)。常見(jiàn)表達(dá)或者過(guò)表達(dá)都是II類啟動(dòng)子，而III類啟動(dòng)子如U6、H1，啟動(dòng)小片段如miRNA、shRNA、sgRNA等，其用于構(gòu)建shRNA和sgRNA載體進(jìn)行敲低或敲除操作。

Ⅱ型啟動(dòng)子在使用特點(diǎn)上又可分為三大類：組成型啟動(dòng)子（廣泛性啟動(dòng)子）、組織特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

此外，不同物種的表達(dá)體系具有不同的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子啟動(dòng)基因表達(dá)也有強(qiáng)弱之分，因此我們需要根據(jù)自己的需求選擇含有相應(yīng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒。關(guān)于啟動(dòng)子的詳細(xì)介紹見(jiàn)往期推文。

3.增強(qiáng)子（enhancer）：增強(qiáng)目的基因轉(zhuǎn)錄

4.篩選標(biāo)記（selectable markers）

       多為抗生素抗性基因，方便后續(xù)篩選陽(yáng)性克隆。原核細(xì)胞篩選標(biāo)記常用的是氨芐青霉素/氨芐西林Amp、氯霉素Cam、卡那霉素Kan、四環(huán)素Tet等；真核細(xì)胞篩選標(biāo)記用的是嘌呤霉素Puro，新霉素neo/G418，潮霉素Hyg或Hygro等。質(zhì)粒圖譜中用抗生素縮寫+R表示，R代表resistance，如AmpR和PuroR等。

抗生素作用機(jī)制及用途見(jiàn)下表

 

5. 多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites，MCS）

       外源 DNA的插入位點(diǎn)，通常位于啟動(dòng)子的下游，具有多個(gè)核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，可通過(guò)酶切/連接方式將外源 DNA 插入到質(zhì)粒。質(zhì)粒圖譜中有些酶切位點(diǎn)右上角標(biāo)注了“*”，代表可能并不僅僅存在單一限制位點(diǎn)，所以一般不選用標(biāo)有星號(hào)的酶切位點(diǎn)。

6.轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)（polyA  signal）

       轉(zhuǎn)錄到AAUAAA（AATAAA）之后，mRNA會(huì)接上polyA并轉(zhuǎn)錄終止。常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)位SV40 polyA，簡(jiǎn)寫為SV40 pA

7. 熒光基因

      可以用激光激發(fā)產(chǎn)生熒光的蛋白，一般會(huì)獨(dú)立表達(dá)或和目的基因融合表達(dá)的方式被設(shè)計(jì)在質(zhì)粒上，起到示蹤、陽(yáng)性檢測(cè)、成像的作用。如RFP、mCherry、GFP和EGFP等。

8.蛋白標(biāo)簽

      蛋白標(biāo)簽大多為較短的短肽，一般融合表達(dá)在目的基因的3’端或5'端，如flag、HA、myc和his等。有了標(biāo)簽，在缺乏針對(duì)目的蛋白的抗體時(shí)就可以很方便的對(duì)目的蛋白做檢測(cè)了

9.其他調(diào)控元件

WPRE：來(lái)自土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，放置在目的基因的上游，能加強(qiáng)目的基因的表達(dá)。

cPPT：來(lái)自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)，提高病毒滴度。

 

三、如何閱讀質(zhì)粒圖譜

以pLKO.1-Puro質(zhì)粒（常用于構(gòu)建shRNA載體）為例，對(duì)質(zhì)粒圖譜進(jìn)行解讀

 

1.首先看箭頭方向

      質(zhì)粒圖譜上都會(huì)存在箭頭，箭頭方向可以代表轉(zhuǎn)錄方向如圖中U6、hPGK、AmpR等啟動(dòng)子（白色箭頭）的方向，也可以代表復(fù)制方向，即 ori（黃色箭頭）的箭頭方向。設(shè)計(jì)引物及插入目的基因的方向是根據(jù)轉(zhuǎn)錄方向（啟動(dòng)子方向）來(lái)定的。由于質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，箭頭可有順時(shí)針和逆時(shí)針?lè)较?，代表兩條DNA鏈，它的啟動(dòng)子在其中一條鏈上，而它的某些基因在另一條鏈上。

2.看ori鑒別質(zhì)粒類型

      前文提到，若質(zhì)粒圖譜上只有一個(gè)ori，表示質(zhì)粒是原核克隆及表達(dá)質(zhì)粒；而圖譜上有3個(gè)ori，則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒。因此該質(zhì)粒為穿梭質(zhì)粒。

 

 

 

3.看啟動(dòng)子確定質(zhì)粒的作用

       該質(zhì)粒圖譜中有7個(gè)啟動(dòng)子（白色箭頭），U6啟動(dòng)子可用于構(gòu)建shRNA和sgRNA載體；hPGK和AmpR啟動(dòng)子啟動(dòng)Puro和Amp抗性基因的表達(dá)，可用于篩選陽(yáng)性克隆。T3和T7啟動(dòng)子分別是噬菌體T3和T7 RNA聚合酶的啟動(dòng)子，lac啟動(dòng)子是大腸桿菌乳糖操縱子的啟動(dòng)子，RSV啟動(dòng)子是rous肉瘤病毒增強(qiáng)子/啟動(dòng)子。

 

4.看篩選標(biāo)記/抗性基因

       圖中有AmpR（氨芐西林抗性基因）和PuroR（嘌呤霉素抗性基因），AmpR用于原核細(xì)胞如大腸桿菌篩選，PuroR用于真核細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞的篩選。當(dāng)大腸桿菌和腫瘤細(xì)胞中不存在該質(zhì)粒時(shí)就無(wú)法表達(dá)抗性基因，因此應(yīng)用氨芐西林或嘌呤霉素可以篩選出陽(yáng)性克隆。各抗生素作用機(jī)制與用途見(jiàn)前文。

 

5.看多克隆位點(diǎn)

       該質(zhì)粒圖譜中圓圈外圍的黑體字母代表酶切位點(diǎn)，可用于插入外源基因。pLKO.1-Puro質(zhì)粒常用于構(gòu)建shRNA載體，插入的shRNA靶序列位于U6啟動(dòng)子下游且緊鄰U6啟動(dòng)子。針對(duì)該質(zhì)粒，我們常選用AgeI和EcoRI這兩個(gè)酶切位點(diǎn)引入外源shRNA靶序列。

 

6.看轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)

       質(zhì)粒圖譜中pA或者poly A代表轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。

 

7.熒光標(biāo)記

      有的質(zhì)粒帶有熒光標(biāo)記，用于直觀判斷質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染成功。如下圖所示，與pLKO.1-Puro相比，pLKO.1-EGFP-Puro主要不同在于多了CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和EGFP序列（箭頭表示），CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)EGFP（增強(qiáng)的綠色熒光蛋白）的表達(dá)。其余部分與pLKO.1-Puro相差不大。

 

 

8.其他

        回到pLKO.1-Puro質(zhì)粒，長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminal repeats，LTR）存在于反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的兩端，即5’ LTR和3’LTR，不編碼蛋白質(zhì)，但含有啟動(dòng)子，增強(qiáng)子等調(diào)控元件。

cPPT來(lái)自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)，提高病毒滴度。

M13 fwd和M13 rev是M13上下游通用引物，可用于后續(xù)測(cè)序。

CAP binding site（CAP結(jié)合位點(diǎn)）在cAMP存在時(shí)激活轉(zhuǎn)錄。

HIV-1Ψ是人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的包裝信號(hào)。 

RRE（Rev response element）允許Rev依賴的mRNA從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)。

gp41 peptide介導(dǎo)HIV與CD4細(xì)胞融合，從而HIV進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

 

想必通過(guò)上面的講解，大家對(duì)質(zhì)粒圖譜的閱讀應(yīng)該有大致的了解，那就找?guī)讖堎|(zhì)粒圖譜練習(xí)吧?？稍?/span>addgene網(wǎng)站（https://www.addgene.org/）搜索想要的質(zhì)粒。如圖：

 

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M2150	Puromycin Dihydrochloride嘌呤霉素鹽酸鹽	25mg
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M6492	Carbenicillin, Disodium Salt 羧芐青霉素鈉	25g
M0891	Kanamycin Sulfate 硫酸卡那霉素	100g
H5570	Tetracyclin HCl 四環(huán)素鹽酸鹽（USP）	25g
G418	G418 Sulfate (Geneticin) 遺傳霉素	5g