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復(fù)合體Ⅳ檢測(cè)試劑盒（微量法100T/96S）
| 貨號(hào) | SH0259 | 售價(jià)（元） | 3120 |
| 規(guī)格 | 100T/96S | CAS號(hào) |
- 產(chǎn)品簡介
- 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0259 |
線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒（微量法100T/96S） |
100管/96樣 |
測(cè)定意義：
線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素C氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C的氧化，并最終把電子傳遞給氧，生成水。
測(cè)定原理：
還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C生成氧化型細(xì)胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。
試劑的組成和配制：
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產(chǎn)品名稱 |
SH0259-100T/96S |
Storage |
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試劑一：液體 |
100ml |
-20℃ |
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試劑二：液體 |
20ml |
-20℃ |
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試劑三：液體 |
1.5ml |
-20℃ |
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試劑四：液體 |
20ml |
4℃ |
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試劑五：粉劑 |
1支 |
-20℃ |
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試劑六：粉劑 |
1支 |
-20℃ |
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說明書 |
一份 |
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需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1ml試劑一和10ul試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿600g，4℃離心5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。
4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做）。
5、步驟4中的沉淀即為線粒體，加入200ul試劑二和2ul 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）工作液的配制：臨用前將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μl樣本和200μl工作液，混勻，記錄550nm處初始吸光值A1和 37℃反應(yīng)30min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意事項(xiàng):
1、若ΔA大于0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），使A1-A2小于0.2，可提高檢測(cè)靈敏度。
2、動(dòng)物肝臟樣本由于酶活性過高， 1分鐘內(nèi)吸光值就會(huì)到達(dá)平臺(tái)期，務(wù)必先進(jìn)行2個(gè)樣本的預(yù)測(cè)定?？蓪颖居迷噭┒♂?/span>10~50倍，反應(yīng)時(shí)間縮到到30秒或1分鐘（計(jì)算公式中代入實(shí)際反應(yīng)時(shí)間，并乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）。其他樣本可按照正常測(cè)定步驟進(jìn)行。
復(fù)合體Ⅳ活力單位的計(jì)算：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3.88×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.008×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2.2×10-4 L；ε：細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=38.39×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.76×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.016×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2.2×10-4 L；ε：細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×104 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。