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正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

順烏頭酸酶（aconitase），三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕帷幟仕岜旧聿灰籽趸?，在順烏頭酸酶作用下，通過(guò)脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進(jìn)一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備。

測(cè)定原理：

ACO催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將NAD⁺ 還原生成NADH，導(dǎo)致340nm處光吸收上升。

組成：

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加3ml蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用

試劑七：粉劑×1支，4°保存；臨用前加36ml試劑四充分溶解；

工作液：臨用前在36ml試劑七中加入3ml蒸餾水、3ml試劑四、3ml試劑五、3ml試劑六充分混勻

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)600g，4℃離心5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。

5、 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體順烏頭酸酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟:

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測(cè)定

（1）將工作液，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20°保存，一星期內(nèi)可用。

（3）在1ml石英比色皿中加入100μl樣本900μl工作液，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 3min20s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

ACO活性計(jì)算:

用石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

 ACO活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=536×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

 ACO（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=108×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

ACO活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.722×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.001 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。