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果糖-6-磷酸激酶(PFK)檢測試劑盒(分光光度法 50T/48S)

貨號(hào) SH0226 售價(jià)(元) 864
規(guī)格 50T/48S CAS號(hào)
  • 產(chǎn)品簡介
  • 相關(guān)產(chǎn)品

貨號(hào)

名稱

規(guī)格

SH0226

果糖-6-磷酸激酶(PFK)檢測試劑盒(分光光度法 50T/48S)

50管/48樣

正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定                                             

測定意義:

PFKEC 2.7.1.11廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖-1,6二磷酸和ADP,是糖酵解過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

測定原理:

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下測定NADH下降速率,即可反映PFK活性。組成:

產(chǎn)品名稱

SH0226-50T/48S

Storage

提取液:液體

60ml

4℃

試劑一:液體

40ml

4℃

試劑二:粉劑

1

-20℃

試劑三:粉劑

1

4℃

試劑四:液體

16μl

4℃

說明書

一份

 

試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存,臨用前加入2.8ml蒸餾水充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20度保存,禁止反復(fù)凍融;

試劑三:粉劑×1支,4℃保存,臨用前加入260μl蒸餾水充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20度保存,禁止反復(fù)凍融;

試劑四:液體16μl×1支,4℃保存,臨用前加入260μl蒸餾水充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20度保存,禁止反復(fù)凍融;

自備儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理:

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(ml)為1000~50001的比例(建議2000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(ml)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1ml提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟和加樣表:

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、工作液(可測25個(gè)樣)的配制:取19ml試劑一和1.26ml試劑二充分混勻;用不完的試劑分裝后-20度保存,禁止反復(fù)凍融;

3、將工作液置于37℃(哺乳動(dòng)物)25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘。

4、加樣表

試劑名稱(μl

測定管

工作液

800

樣本

30

試劑三

5

試劑四

5

將上述試劑按順序加入1 ml石英比色皿中,立即混勻,加試劑四的同時(shí)開始計(jì)時(shí),記錄在340 nm波長下20秒時(shí)的初始吸光度A11020秒時(shí)的吸光度A2,計(jì)算ΔA=A1-A2

注意:不同勻漿組織中PFK活力不一樣,做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做1-2只預(yù)試,若ΔA>0.5,則說明活力太高,必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液(計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)),或縮短反應(yīng)時(shí)間至2min5min,使ΔA<0.5,以提高檢測靈敏度。

PFK活力單位的計(jì)算

1、血清(漿)PFK活力的計(jì)算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個(gè)酶活力單位。

PFKnmol/min/ml[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=450×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PFK活力計(jì)算:

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個(gè)酶活力單位。

PFKnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個(gè)酶活力單位。

PFKnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=450×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個(gè)酶活力單位。

PFKnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(2000×V÷V樣總)÷T=0.225×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,8.4×10-4 L;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.03 ml;V樣總:加入提取液體積,1 ml;T:反應(yīng)時(shí)間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mlW:樣本質(zhì)量,g2000:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),2000萬。

 

 

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