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正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

還原糖廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。植物體內(nèi)的還原糖主要包括葡萄糖、果糖和麥芽糖等，是最常見的單糖和雙糖，其中葡萄糖和果糖不僅是呼吸作用的主要底物，也是進(jìn)一步合成蔗糖、淀粉和纖維素的底物。

測(cè)定原理：

加熱促進(jìn)堿性溶液中3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖生成棕紅色氨基化合物，在540nm有特征吸收峰；在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖含量與540nm吸光度成線性關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出樣品中還原糖的量。

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、蒸餾水。

樣品中還原糖的提?。?/span>

1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議1000萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入2ml試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次），轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時(shí)水分散失），80℃水浴中40min并且振蕩8~10次，8000g，25℃離心10min，取上清供測(cè)定用。

2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.2g組織，加入2ml試劑一），冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時(shí)水分散失），80℃水浴中40min并且振蕩8~10次，8000g，25℃離心10min，取上清供測(cè)定用。

3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（ml）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議取0.2ml血清（漿）加入2ml試劑一），冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時(shí)水分散失），80℃水浴中40min并且振蕩8~10次，8000g，25℃離心10min，取上清供測(cè)定用。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 調(diào)節(jié)水浴鍋至95℃。

3、 在EP管中加入下列試劑：

將各管搖勻，在95℃水浴中加熱5min（蓋緊，防止水分散失），取出后立即冷卻至室溫，混勻。在540nm波長(zhǎng)下讀取對(duì)照管和測(cè)定管吸光值。計(jì)算ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

注意：如果ΔA大于2，需要將樣本用試劑一稀釋，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)（若顯色后出現(xiàn)分層現(xiàn)象，可改用蒸餾水稀釋）。

還原糖含量計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 8.3796x- 0.3034；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y為吸光值。

2、按樣本鮮重計(jì)算：

還原糖(μg/g鮮重)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(W×V1÷V2)=238.67×(ΔA＋0.3034)÷W

3、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

還原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(V1×Cpr)=119.34×(ΔA＋0.3034)÷Cpr

4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

還原糖(μg /10⁴ cell)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷（1000×V1÷V2）=0.239×(ΔA＋0.3034)

5、按血清（漿）體積計(jì)算：

還原糖(μg/ml)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷（V3×V1÷V2）=1193.4×(ΔA＋0.3034)

1000：1mg/ml=1000μg/ml；V1：加入樣本體積，0.7ml；V2：加入提取液體積，2 ml；V3：加入血清（漿體積），0.2ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；1000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，1000萬(wàn)。

注意：最低檢測(cè)限為1mg/g鮮重或10μg/mg prot