测定意义：

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和NADPH含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm下检测吸光值，从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH，从而检测NADP+含量。

组成：

试剂二：粉剂×1支，-20 ℃保存，用时加入3ml蒸馏水，混匀；溶解后4 ℃保存一周；

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入3ml蒸馏水，混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1支，4 ℃保存，用时加入3ml蒸馏水，混匀；溶解后4℃保存一周；

自备仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

NADP+和NADPH的提取：

1、 血清（浆）中NADP⁺和NADPH的提取

NADP⁺的提取：按照血清（浆）体积（ml）：酸性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1ml血清（浆），加入1ml酸性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：按照血清（浆）体积（ml）：碱性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1ml血清（浆），加入1ml碱性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1ml酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（ml）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1ml碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、 细胞或细菌中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：酸性提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：碱性提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μl上清液，加入500μl酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、 加样表(在1.5ml棕色EP管中按下表依次加样）：

充分混匀，静置5min后，20000g，25℃离心5min，弃上清，沉淀中加入：

混匀，取200μl转移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。

注意事项

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若NADP+测定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH测定中△A（A2-A1）≤0.0259，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间20min延长到60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取0.2g样本或0.2ml样本加入1ml提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒100管保证测48个NADP⁺或NADPH.

NADP+和NADPH含量的计算：

（一）NADP⁺含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.0985x + 0.0144，R² = 0.9998；其中y为△A，x为NADP⁺浓度nmol/ml

1、血清（浆）中NADP⁺含量计算

NADP⁺含量(nmol/ml）=[ (△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144）

2、组织、细菌或细胞中NADP⁺含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADP⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADP⁺ (nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144）÷W

 (3)按细菌或细胞密度计算

NADP⁺ (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144）

（二）NADPH含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.6198x + 0.0259，R² = 0.9977；其中y为△A，x为NADPH浓度nmol/ml

1、血清（浆）中NADPH含量计算

NADPH含量(nmol/ml）= [(△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259）

2、组织、细菌或细胞中NADPH含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADPH (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259）

V1：加入反应体系中样本体积，0.02ml；V2：加入提取液体积，2ml；V3：加入血清（浆）体积：0.1ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

注意：最低检测限为0.01nmol/ml或0.01nmol/g鲜重 或0.001nmol/mg prot