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測定意義：

乙醇俗稱酒精，是最常見的一元醇，在檢測酒的質量、分析血液乙醇含量和果蔬品質判斷中通常需要頻繁、大量地檢測乙醇含量。

1.乙醇是酒的主要成分，是衡量酒質量的重要指標之一。我國是世界上最早發(fā)明釀酒的國家，也是酒類產(chǎn)品消費大國，其消費量居世界之首。因此，快速、準確測定酒中乙醇含量，對于確保酒的質量和保護消費者的健康具有重大意義。

2.乙醇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最基本的抑制物，如果乙醇被大量攝入，會不可逆抑制呼吸甚至導致死亡，血液中乙醇檢測結果通常作為認定是否酒后駕駛或醉酒駕駛的依據(jù)。

3.乙醇是判斷儲藏過程中果蔬品質變化的重要指標，研究表明，適當?shù)囊掖继幚砟軌驕p少腐爛和減輕果蔬生理病害、延緩果蔬成熟和衰老進程，從而延長貨架壽命。因此，簡便、準確和快速測定果蔬中乙醇含量具有非常重要的意義。

測定原理：

乙醇在乙醇脫氫酶的催化下氧化脫氫生成乙醛，同時，NAD被還原生成NADH，NADH在1-mPMS的作用下使WST-8顯橙黃色，通過450 nm下測定吸光值變化可測得乙醇含量。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶, -20℃保存；臨用前加入6 ml試劑三充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存；

自備儀器和用品：

酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板、研缽、冰、蒸餾水。

乙醇提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：蒸餾水體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml蒸餾水），進行勻漿，8000g，25℃離心10min，取上清待測。

2. 細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：蒸餾水體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1ml蒸餾水），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）， 8000g，25℃離心10min，取上清待測。

3. 血清（漿）等液體樣品：直接測定。

測定步驟：

1. 酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至450nm。

2. 工作液的配制：臨用前按照樣本數(shù)量，按以下比例配制工作液

3. 樣本測定

按下表在96孔板中加入如下試劑

混勻后記錄450nm下測定初始吸光值A1，和37℃避光孵育10min后的吸光值A2，計算

△A=A2-A1。

乙醇含量計算：

標準條件下測定回歸方程為y = 0.0256x + 0.0055          R² = 0.9991；

x為乙醇含量（μmol/ml），y為吸光值差值△A。

1. 按照血清（漿）體積計算

乙醇含量（μmol/ml）= (△A-0.0055)÷0.0256

=39.1×(△A-0.0055)

2. 按照樣品質量計算

乙醇含量（μmol/g鮮重）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷(W ×V1÷V2）

= 39.1×(△A-0.0055)÷W

3. 按照細菌或細胞密度計算

乙醇含量（μmol/10⁴ cell）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷（500×V1÷V2）

=0.078×(△A-0.0055)

V1：加入反應體系中樣本體積，0.04ml；V2：加入提取液體積，1 ml； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬；

注意事項：

測定前取1-2個樣做預實驗，若△A﹥0.3或乙醇含量﹥10μmol/ml，需將樣本用蒸餾水稀釋后再測定，以確保測定的準確性。

最低檢測限：0.02μmol/ml。