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膠原酶（Collagenase，CAS NO. 9001-12-1）是一種蛋白水解酶，常用來(lái)消化細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。作為一種肽鏈內(nèi)切酶，膠原酶特異性識(shí)別Pro-X-Gly-Pro序列（高頻出現(xiàn)在膠原collagen，很少在其他蛋白中發(fā)現(xiàn)）并切割氨基酸（X）和甘氨酸（Gly）之間的肽鍵。不同于其他蛋白酶，膠原酶是唯一一種可識(shí)別并降解具三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維，這種膠原纖維廣泛存在結(jié)締組織。

商業(yè)化膠原酶來(lái)源于溶組織梭菌（Clostridium histolyticum），是一種酶粗提物，不僅含有梭菌蛋白酶A（Clostridiopeptidase A），能夠降解天然膠原和網(wǎng)狀纖維；還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等，分別用以水解存在結(jié)蹄組織和上皮組織細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白、多糖和脂質(zhì)等。目前商業(yè)化的膠原酶因所含組分的差異分為五類，其在應(yīng)用上具有一定區(qū)分，詳見(jiàn)下表1。

本品是II型膠原酶，活性≥125 CDU/mg凍干物，比I型膠原酶含更高的梭菌蛋白酶活性，通常用作心臟、骨、肝、甲狀腺、唾液腺和軟骨等組織的原代細(xì)胞制備。

產(chǎn)品性質(zhì)：

1）EC NO：3.4.24.3

2）CAS NO：9001-12-1

3）酶活力單位定義：在37℃，pH7.4，Ca2+的條件下，5h內(nèi)水解牛跟腱膠原產(chǎn)生多肽量相當(dāng)于1μmol亮氨酸茚三酮顏色變化所需的酶量定義為1個(gè)膠原消化單位（collagen digestion unit，CDU）。

保存與運(yùn)輸方法

保存：-20℃干燥保存，2年有效。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

使用方法

一、儲(chǔ)存液制備

1）直接往100mg膠原酶內(nèi)加入100μl含鈣鎂的HBSS緩沖液，輕輕漩渦震蕩確保完全溶解混勻。

2）根據(jù)具體批次的酶活力，用含鈣鎂的HBSS緩沖液調(diào)整酶濃度到100U/μl（1000×儲(chǔ)存液），之后用低蛋白吸附濾膜過(guò)濾除菌。

3）立即使用或?qū)?chǔ)存液根據(jù)單次用量分裝，置于-20℃避光保存。

4）使用前置于冰上融化，避免反復(fù)凍融。建議膠原酶的工作濃度范圍50-200U/ml（或0.5-2.5mg/ml），具體使用濃度請(qǐng)根據(jù)具體消化對(duì)象或參考文獻(xiàn)來(lái)調(diào)整。

二、組織分離

1）用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm小片，之后用含鈣鎂的HBSS緩沖液清洗組織片幾次；

2）加足量含鈣鎂的HBSS緩沖液浸沒(méi)組織片，之后按照50-200U/ml用量加入適量膠原酶；

3）37℃孵育4-18h，置于水平搖床并且孵育體系加入3mM CaCl2可提高消化效率。

4）將消化好的細(xì)胞混合物用無(wú)菌的不銹鋼或尼龍網(wǎng)過(guò)篩。殘留組織可再添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃孵育以進(jìn)一步解離。

5）將過(guò)篩收集到的細(xì)胞用不含膠原酶的HBSS緩沖液清洗幾遍。

6）低速離心，吸掉清洗液。最后用適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或動(dòng)法進(jìn)行活細(xì)胞數(shù)檢測(cè)。

三、器官灌注

1）將膠原酶加入37℃預(yù)熱含鈣鎂的HBSS緩沖液，使其濃度為50-200U/ml，或根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)體系調(diào)整；另加入3mM CaCl2可提高消化效率。

2）按照針對(duì)特定器官的預(yù)優(yōu)化頻率來(lái)進(jìn)行灌注；

3）將收集到的細(xì)胞/組織混合碎片用無(wú)菌的不銹鋼或尼龍網(wǎng)過(guò)篩。殘留組織可再添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃孵育以進(jìn)一步解離。

4）將過(guò)篩收集到的細(xì)胞用不含膠原酶的HBSS緩沖液清洗幾遍。

6）低速離心，吸掉清洗液。最后用適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或手動(dòng)法進(jìn)行活細(xì)胞數(shù)檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

表1：

相關(guān)產(chǎn)品：